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RIPA裂解液(中)是一种细胞组织快速裂解并获得总蛋白的裂解液，主要由Tris、NP-40、sodium deoxycholate等组成，并含有多种蛋白酶抑制剂成分，可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。其裂解强度大于NP-40裂解液、RIPA裂解液(弱)，所获得的蛋白质可用于Western、免疫沉淀等。

• 去除贴壁细胞的培养液后，如果血清中的蛋白没有干扰，可以不用清洗。
  
• 如果裂解不充分可以适当增加裂解液的用量，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。
  
• 如果细胞量较多，必需分装成50～100万细胞/离心管，然后再裂解，大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。
  
• 如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈Vortex使样品裂解充分，然后同样离心取上清用于后续实验，直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器裂解的充分。
  
• Medium RIPA Lysis Buffer含有特殊成分，在低温情况下有可能出现浑浊现象，可37℃水浴促其溶解，不会影响使用效果；溶解时间不易过长，避免成分失效，4℃保存即可，长期不用亦可-20℃保存。
  
• PMSF溶液可置4℃保存1～2周，-20℃可保存1年以上，室温放置2天即可能失效。
  
• 裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物属正常现象，该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物，在不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下可以直接离心取上清用于后续实验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。
  
• 细胞裂解的操作步骤，应置于冰上或4℃进行。
  
• 试剂开封后请尽快使用，以防影响后续实验效果。

• 贴壁细胞
  
  • 去除贴壁细胞的培养液，用PBS、NS或无血清培养液清洗1次，低速离心，弃上清，留取沉淀。
    
  • 6孔板每孔加入150～250μL含有PMSF的Medium RIPA Lysis Buffer，用手指轻弹细胞，使其松散，移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触，置于冰上或4℃裂解，通常裂解液作用于细胞1～3s内，细胞就会被裂解，通常6孔板每孔细胞加入150μL裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200～250μL。
    
  • 10000～12000g 4℃离心5～10min(如无低温离心机，室温离心亦可)，取上清。
    
  • 后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
• 悬浮细胞
  
  • 低速离心悬浮细胞，弃上清，用PBS、NS或无血清培养液清洗1次，离心留取沉淀。
    
  • 下同贴壁细胞2～4操作步骤。
• 组织样本
  
  • 组织剪碎，越小越好。
    
  • 放置液氮或超低温冰箱中冷冻30min，用液氮研磨，尽量控制在1～2min之内以减少蛋白的降解，每20mg组织加入150～250μL含有PMSF的Medium RIPA Lysis Buffer，冰上或4℃裂解15～30min。
    
  • 亦可按照每20mg组织加入150～250μL含有PMSF的Medium RIPA Lysis Buffer用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆，直至充分裂解，该过程尽量控制在2～5min之内以减少蛋白的降解。
    
  • 下同贴壁细胞2～4操作步骤。